本课目标：拿到一条登革病毒完整基因组，能说出它有多长、由哪些部分组成、10 个蛋白各叫什么、各自大概负责什么；能说清 4 个血清型之间是什么关系，为什么二次感染另一个血清型反而更危险。
先记住一句话：登革病毒的基因组只有约 10.7 kb、一个开放阅读框，却要先翻译成一条约 3400 个氨基酸的多聚蛋白，再由病毒蛋白酶和宿主蛋白酶切成 3 个结构蛋白加 7 个非结构蛋白。看懂这张“切割图”，后面所有基因组分析都有了落点。
一、理论
1. 基因组总览：一张图记住
登革病毒（DENV）属于黄病毒科黄病毒属，是 +ssRNA 病毒，基因组不分节段，全长约 10.7 kb（不同毒株在约 10.6–11 kb 之间浮动）。结构从 5′ 端到 3′ 端依次是：
5′ UTR（约 100 nt）— 单个开放阅读框 ORF（约 10.2 kb）— 3′ UTR（约 450 nt）
ORF 翻译出一条多聚蛋白，再切割成 10 个成熟蛋白，顺序固定不变：
C — prM — E — NS1 — NS2A — NS2B — NS3 — NS4A — NS4B — NS5
前 3 个是结构蛋白，构成病毒颗粒；后 7 个是非结构蛋白，主要负责复制病毒 RNA、切割多聚蛋白和对抗宿主免疫。记住这个顺序：任何一条黄病毒基因组注释，蛋白顺序都一样，这是黄病毒属的共同特征。
2. 结构蛋白：病毒颗粒的三个零件
| 蛋白 | 长度（约） | 在哪里 / 干什么 |
|---|---|---|
| C（衣壳蛋白） | 约 100 个氨基酸 | 包在基因组外面，把 RNA 折叠进病毒颗粒内部；带正电荷，与 RNA 结合 |
| prM / M（膜前体蛋白 / 膜蛋白） | prM 约 166 个氨基酸，成熟 M 约 75 个氨基酸 | prM 在病毒成熟过程中被宿主蛋白酶 furin 切掉一段，变成 M；未成熟病毒颗粒表面是 prM + E，成熟后是 M + E |
| E（包膜蛋白） | 约 495 个氨基酸 | 病毒颗粒表面最主要的蛋白，负责结合宿主细胞受体、介导膜融合；也是中和抗体最主要的靶点，疫苗和血清学检测的核心 |
E 蛋白分三个结构域：结构域 I（中央）、结构域 II（含融合环，负责膜融合）、结构域 III（与受体结合最相关）。看文献时常看到“E 蛋白结构域 III”，指的就是这一段。
3. 非结构蛋白：复制机器与免疫对抗
| 蛋白 | 长度（约） | 主要功能 |
|---|---|---|
| NS1 | 约 352 个氨基酸 | 参与病毒复制复合体形成；分泌型 NS1 进入血液，是登革早期诊断的抗原靶点（NS1 抗原检测） |
| NS2A | 约 218 个氨基酸 | 膜蛋白，参与复制复合体组装与病毒颗粒组装；拮抗干扰素信号 |
| NS2B | 约 130 个氨基酸 | NS3 蛋白酶的辅助因子，没有 NS2B，NS3 切不动多聚蛋白 |
| NS3 | 约 618 个氨基酸 | 双功能酶：N 端是蛋白酶（切多聚蛋白），C 端是解旋酶 / NTP 酶（解开 RNA 双链供复制） |
| NS4A | 约 150 个氨基酸 | 参与复制复合体的膜重塑，诱导膜结构改变以容纳复制机器 |
| NS4B | 约 248 个氨基酸 | 拮抗干扰素信号，抑制宿主先天免疫 |
| NS5 | 约 900 个氨基酸 | 最大的蛋白：N 端是甲基转移酶（给 RNA 加帽），C 端是 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 RdRp（复制基因组）；也是拮抗干扰素的关键蛋白 |
4. 5′ UTR 与 3′ UTR：不是“无用区”
5′ UTR 约 100 nt：含一个 5′ 茎环结构（SLA），是 NS5 聚合酶结合并启动复制的信号。5′ 端没有帽子结构（黄病毒基因组 RNA 5′ 端是三磷酸），翻译起始依赖 5′ UTR 的结构。
3′ UTR 约 450 nt：含多个保守的茎环与哑铃结构，参与基因组环化（5′ 端与 3′ 端互补配对形成环状），是复制启动的必要条件。3′ UTR 还会产生亚基因组 RNA（sfRNA），与拮抗宿主免疫有关。
做分析时注意：UTR 区在不同血清型之间保守程度不一，3′ UTR 的保守结构常被拿来设计通用引物，但引物设计时要先比对确认。
5. 4 个血清型：同种病毒，四种“面孔”
登革病毒有 4 个血清型：DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4。血清型之间氨基酸序列一致性约 60%–70%（不同蛋白差异不同，E 蛋白约 60%–70%），核苷酸一致性更低。四个血清型在分类学上同属一个种（Orthoflavivirus denguei），但免疫学上彼此区分：感染其中一个血清型产生的中和抗体，对另外三个血清型的中和能力很弱。
| 血清型 | 参考株（常用） | RefSeq 登录号 |
|---|---|---|
| DENV-1 | Hawaii | NC_001477.1 |
| DENV-2 | New Guinea C（NGC） | NC_001474.2 |
| DENV-3 | H87 | NC_001475.2 |
| DENV-4 | H241 | NC_002640.1 |
6. 为什么二次感染更危险：抗体依赖增强（ADE）
第一次感染某一个血清型后，身体会产生针对该血清型的中和抗体，获得对该血清型的长期免疫。但这些抗体对另一个血清型只能“结合、不能中和”：抗体带着病毒结合到免疫细胞表面的 Fc 受体上，反而帮助病毒更容易进入细胞复制，病毒载量更高、病情更重，这就是抗体依赖增强（ADE）。
这就是为什么登革的流行病学调查要分血清型统计：一个地区先后流行过 DENV-1 又流行 DENV-2，第二次流行时的重症比例往往更高。也是登革疫苗研发困难的核心原因之一：疫苗必须同时对 4 个血清型都产生均衡的中和抗体，只防住一个是不够的。
三者都是黄病毒属、基因组结构完全一样（5′ UTR — C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5 — 3′ UTR），蛋白顺序相同。区别在于：序列差异、E 蛋白表面特征、以及宿主与致病特点不同。学会拆一条登革基因组，就等于学会拆所有黄病毒的基因组，换个登录号就能复用同一套方法。
7. 常见误区
（1）以为登革病毒有 4 个“种”，错了，4 个血清型同属一个种。
（2）以为多聚蛋白就是一个蛋白，错了，它要切成 10 个蛋白才有功能，比对与注释都要按切开后的蛋白做。
（3）以为 NS1 只是个复制蛋白，错了，分泌型 NS1 是临床上最早能测到的抗原之一。
（4）以为感染过一次登革就免疫了，错了，只对同血清型免疫，异型二次感染反而可能更重。
（5）以为 E 蛋白全长都一样重要，错了，抗体靶点集中在特定结构域，突变分析要先定位到结构域再解读。
二、操作
本课需要 Python + Biopython（第 9 课会系统讲 Biopython，这里先照抄运行）。如果还没装，先执行 pip install biopython。
操作 1：下载一条登革病毒完整基因组并读注释
from Bio import Entrez, SeqIO
Entrez.email = "你的邮箱@example.com" # NCBI 要求填邮箱，换成你自己的
handle = Entrez.efetch(db="nucleotide", id="NC_001474.2",
rettype="gb", retmode="text")
record = SeqIO.read(handle, "genbank")
handle.close()
print("登录号：", record.id)
print("全长：", len(record.seq), "nt")
print("描述：", record.description)
for f in record.features:
if f.type == "CDS":
print(f.qualifiers.get("gene", ["?"])[0],
f.qualifiers.get("product", ["?"])[0],
int(f.location.end) - int(f.location.start), "nt")跑完后核对三件事：全长是不是约 10.7 kb；CDS 是不是只有一条（多聚蛋白）；FEATURES 表里能不能找到 10 个成熟蛋白的注释（有的记录只标多聚蛋白 CDS，成熟蛋白在 mat_peptide 特征里）。
操作 2：算出 10 个蛋白各自的长度
# 接操作 1，继续用 record
for f in record.features:
if f.type == "mat_peptide":
gene = f.qualifiers.get("gene", ["?"])[0]
prod = f.qualifiers.get("product", ["?"])[0]
length = (int(f.location.end) - int(f.location.start)) // 3
print(f"{gene:6s} {prod:40s} 约 {length} aa")把输出结果和本课第三节的表对照：NS5 是不是最长、E 是不是约 495 aa、C 是不是最短。注意：有的记录没有 mat_peptide 特征，改用 CDS 的 /note 或直接查文献里的切割位点表，不要硬凑数字。
操作 3：比较 4 个血清型的 E 蛋白
from Bio import Entrez, SeqIO
accs = {"DENV-1": "NC_001477.1", "DENV-2": "NC_001474.2",
"DENV-3": "NC_001475.2", "DENV-4": "NC_002640.1"}
for name, acc in accs.items():
h = Entrez.efetch(db="nucleotide", id=acc, rettype="gb", retmode="text")
rec = SeqIO.read(h, "genbank")
h.close()
print(name, acc, "全长", len(rec.seq), "nt")下一步（选做）：把 4 条 E 蛋白序列提出来做两两比对，算氨基酸一致性，验证“血清型之间约 60%–70%”这个说法。比对工具第 17 课会系统讲，现在先把 4 条序列存成 FASTA 文件备用。
三、实践
练习 1：拆一条基因组（必做）
任选一个血清型的参考株（建议 DENV-2 NGC，NC_001474.2），按操作 1–2 跑一遍，交一张表：10 个蛋白的名称、长度（aa）、在基因组上的起止位置（nt）。要求：起止位置从 GenBank 注释原文抄，不要自己算错；NS2B 这类小蛋白不要漏。
练习 2：血清型对照表（必做）
按操作 3 下载 4 个血清型的参考株，填表：血清型、参考株名、登录号、全长（nt）、E 蛋白长度（aa）。再用一句话写清：为什么登革疫苗必须同时覆盖 4 个血清型。
练习 3：思考题（选做，写三行就行）
如果某条新测序的登革病毒基因组注释里只有一条多聚蛋白 CDS、没有 10 个成熟蛋白，你要怎么切出 10 个蛋白？提示：切割位点序列是保守的，可以从参考株的注释里找。
交作业：把练习 1 的表和练习 2 的表发到聊天里，我来批改，错的地方我会指出错在哪一项、应该怎么查。
四、验收
下面每一项都要能做到才算学完，勾选会保存在本机浏览器里。